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大黄蒽醌类化合物致肝细胞毒性研究

  目的:文献报道大黄具有肝毒性及致癌性,其中蒽醌类化合物为大黄的主要化学成分。本研究利用高内涵检测技术和碱性彗星电泳研究大黄酸(Rhein)、大黄酚(Chrysophano1)、大黄素甲醚(Physcim)和芦荟大黄素(Aloe-emodin)对正常人源肝细胞HepaRG的潜在的细胞毒性及DNA断裂作用。方法:1)高内涵法检测细胞毒性:HepaRG细胞以3.5×104个/mL密度接种于96板,每孔100μL。细胞达到对数生长期后更换含0.5%DMSO,H2O2(25μM)和含不同浓度的大黄蒽醌类化合物的培养基(大黄酸和大黄酚的处理浓度区间在0.2~50μg/mL,芦荟大黄素和大黄素甲醚的处理浓度区』可为0.1~25μg/mL,n=8)继续培养24h。细胞经Hochest 33342(2.5μg/mL)染色细胞核后,分别用DCFH-DA(12.5μM)、Mitotracker Red CMX-Ros(100 nM)和Fluo4-AM(0.75μM)染色以测定细胞内ROS、线+水平,并采用IN Cell Analyzer 2000高内涵细胞成像分析系统对荧光强度进行测定。2)DNA损伤分析:使用CometAssay(?)试剂盒(Trevigen,USA)。细胞经大黄蒽醌类化合物(大黄酸和大黄酚为50μg/mL;芦荟大黄素和大黄素甲醚为25μg/mL)处理24h后制备单细胞悬液。将细胞与0.5%低熔点胶混合后滴片,玻片置2~8℃避光裂解、解旋,以电压0.7 V/cm,电流300 mA的条件电泳20 min。标本经pH 7.4 Tris-HCl中和后以无水乙醇脱水,采用SYBR GreenⅠ(1:10000)染色并在荧光显微镜下拍照。分析50个细胞tail%DNA和Olive Tail Moment的中位数的平均值(n=2)。上述结果均采用单因素方差分析对结果的显著性进行检验。结果:1)细胞毒性:各给药组与0.5%DMSO对照组比较,大黄素甲醚25μg/mL组胞内ROS含忧;量显著升高(P0.05),且存在剂量相关性趋势;大黄素甲醚25μg/mL和12.5μg/mL组、大黄酚50μg/mL和25μg/mL组、大黄酸50μg/mL和25μg/mL组细胞内染料进入细胞的水平显著减少(P0.05),提示线粒体损伤程度显著增加;芦荟大黄素高浓度组25μg/mL和12.5μg/mL、大黄酸高浓度组50μg/mL呈显著性升高,且存在剂量相关趋势。2)DNA断裂分析:与阴性对照组比较(1.82±0.04),大黄酸(6.38±0.04)、大黄酚(5.76±0.04)和芦荟大黄素(5.85±1.93)的tail%DNA均有显著性升高,(P0.05);,而大黄素甲醚(1.57±0.078)在25μg/mL浓度作用下未见DNA断裂。结论:4种大黄蒽醌类化合物均可不同程度地对肝细胞产生毒性。其中大黄素甲醚对升高活性氧和线粒体损伤的作用较为显著,芦荟大黄素的毒性主要表现为对肝细胞游离Ca2+水平的调控作用。氧化应激损伤可能是致潜在肝细胞毒性和遗传毒性的重要分子机制之一。

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